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Hematología: Citoquímica - Peroxidasa Leucocitaria

Escrito por Administrator el . Publicado en Hematología

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 Citoquímica

Peroxidasa Leucocitaria

La Peroxidasa leucocitaria (Mieloperoxidasa) de Sigma-Aldrich se utiliza para la demostración histoquímica en peroxidasa leucocitaria. Los reactivos de peroxidasa leucocitaria son para uso diagnóstico in vitro.

Los métodos clásicos de la localización citoquímica de la mieloperoxidasa (MP) incluyen el uso de benzidina1 o diaminobenzidina2. En 1977, Hanker y cols.3 describieron el uso de p-fenilenediamina y catecol para detectar la peroxidasa de rábano inyectada. Este sistema indicador es la base del procedimiento de Sigma-Aldrich al detectar la mieloperoxidasa por medio de la siguiente reacción:

MP

p-fenilenediamina + Producto de reacción insoluble marrón-negro

Catecol + H2O2

REACTIVOS

TAMPÓN TRIZMAL™ 6,3 CONCENTRADO,  con cloroformo como conservante.

REACTIVO INDICADOR DE PEROXIDASA,

p-fenilenediamina diHCl (1 parte) y catecol (2 partes).

SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA ÁCIDA,

 Hematoxilina certificada, 1 g/l, pH 3,3 a 25 °C.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:

Almacenar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado y la solución de hematoxilina ácida a temperatura ambiente (18–26 °C).

El reactivo indicador de peroxidasa debe almacenarse refrigerado (2–8 °C).

La solución de hematoxilina ácida no debe devolverse al recipiente original después de su uso en un vaso de Coplin.

El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato debe guardarse en el frigorífico (2–8 °C). Desechar si presenta turbidez.

Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad.

DETERIORO:

Desechar el tampón Trizmal™ 6,3 concentrado si presenta turbidez.

Desechar la solución de hematoxilina ácida cuando el tiempo requerido para obtener

la tinción adecuada supere en más de 5 minutos el tiempo recomendado en el procedimiento.

PREPARACIÓN:

El tampón Trizmal™ 6,3 diluido se prepara mezclando 1 volumen de tampón TRIZMAL™ 6,3 concentrado, número de catálogo 90-3C, con 9 volúmenes de agua desionizada. Utilizar una sola vez y desecharlo.

La solución fijadora de etanol, 95 % (v/v), se prepara mezclando 5 ml de formaldehído al 37 % con 45 ml de etanol al 95 %. Las preparaciones deben ser del día. Mantenga el envase bien cerrado.

El peróxido de hidrógeno al 3 % en una solución salina tamponada con fosfato se prepara añadiendo 1 parte de peróxido de hidrógeno, 30 %, a 9 partes de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Debe prepararse al momento.

 

PROCEDIMIENTO

RECOGIDA DE LA MUESTRA:

Se recomienda que la recogida de la muestra se lleve a cabo de acuerdo con las directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningún método de prueba puede garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o muestras de tejido deben considerarse potencialmente infecciosos.

Para el ensayo deben utilizarse frotis de sangre total o de médula ósea recién preparados. La sangre puede recogerse en heparina o EDTA. Debe reducirse al mínimo la exposición a la luz ya que la peroxidasa leucocitaria es fotosensible. Los frotis sin fijar son estables durante 3 semanas si se guardan en la oscuridad1. Antes de la fijación, los frotis deben dejarse al aire durante 10 minutos, protegidos de la luz.

MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO:

Solución de formaldehído, 37 %

Etanol, 95 % (v/v)

Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, número de catálogo P 3813

Peróxido de hidrógeno, 30 %

NOTAS:

A efectos de comprobación del funcionamiento del sistema, se recomienda procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las muestras de paciente.

Aunque la mieloperoxidasa generalmente se considera un marcador de células de alineación mielocítica, es obligatorio reconocer que las células monocitoides también pueden mostrar actividad leve de peroxidasa.

Los datos obtenidos mediante este procedimiento sólo sirven como ayuda en el diagnóstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clínicas o información de diagnóstico.

PROCEDIMIENTO:

1. Fijar los frotis a temperatura ambiente durante 30 segundos con solución fijadora.

2. Lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 2 minutos y secar al aire durante 10 minutos, en la oscuridad.

3. Precalentar 50 ml de tampón TRIZMAL™ 6,3 diluido, en un baño de agua a 37 °C.

4. Inmediatamente antes de su uso, añadir 1 vial de reactivo indicador de peroxidasa, de hidrógeno al 3 %, al tampón Trizmal™ 6,3 diluido precalentado. Mezclar a conciencia. Desechar después de su uso.

5. Colocar los portaobjetos lavados, fijados (paso 2) con solución de reactivo indicador de peroxidasa (paso 4) durante 30 minutos, en un baño de agua a 37 °C, en la oscuridad.

6. Tras la incubación, lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 15–30 segundos y dejarlos secar.

7. Contrateñir los portaobjetos con solución de hematoxilina ácida,

8. Aclarar los portaobjetos en agua desionizada corriente durante 15–30 segundos.

Secar los portaobjetos al aire y examinarlos con el microscopio.

 

CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO

Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tiñeron para mieloperoxidasa de acuerdo con este procedimiento y mediante el método de benzidina1.

Los neutrófilos mostraron una granulación marrón-negra con este procedimiento, y una granulación azul con el procedimiento de benzidina. En ambos casos, los monocitos se tiñeron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.

 

 

 

 

 

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