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Inmunología: Procedimientos para la Detección e Identificación de Anticuerpos Eritrocitarios

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Procedimientos Para la Detección e Identificación de Anticuerpos Eritrocitarios

Lic. Antonio Bencomo Hernández


En Inmunohematología se ha desarrollado una amplia gama de procederes de detección e identificación de anticuerpos eritrocitarios in vitro, por lo cual se realiza una revisión de técnicas y métodos empleados con este objetivo, como son el método que utiliza eritrocitos pretratados con enzimas proteolíticas y las técnicas de Polibreno, que utiliza solución de baja fuerza iónica (LISS), la de antiglobulina indirecta, la de aglutinación en gel, la inhibición de la aglutinación, la hemólisis y la adherencia de eritrocitos en fase sólida. Se abordan los problemas que afectan a la reacción de aglutinación entre el antígeno y el anticuerpo; para una mejor comprensión la reacción de aglutinación se subdivide en su primera y segunda etapa. En la primera etapa los factores que se analizan son concentración de antígeno y anticuerpo, pH, temperatura, fuerza iónica y tiempo de incubación; en la segunda etapa la característica del anticuerpo, localización y número de sitios antigénicos, fuerzas que mantienen la distancia entre los eritrocitos, uso de la albúmina bovina, uso de enzimas, efecto de dosis y efecto de moléculas con carga positiva.

DeCS: REACCIONES ANTIGENO-ANTICUERPO/inmunología; ERITROCITOS; SITIOS DE ENLACE DE ANTICUERPOS; TECNICAS INMUNOLOGICAS.

Los requerimientos transfusionales de la mayoría de los pacientes que necesitan de una transfusión sanguínea, se cumplen al administrar sangre de donantes de igual fenotipo ABO y RhD que la del paciente. Numerosos antígenos de grupos sanguíneos diferentes al A, B y RhD son ignorados en el acto transfusional, debido a que muy pocas personas poseen anticuerpos dirigidos contra alguno de ellos.1

Del 0,5 al 1,5 % de los pacientes presentan anticuerpos resultantes de la exposición a células extrañas que ingresaron al organismo por vía transfusión o embarazo. Estos anticuerpos eritrocitarios se pueden detectar e identificar por diferentes procederes, sin embargo, existen factores que afectan la reacción entre el anticuerpo y el antígeno, los factores pueden estar asociados con el antígeno, con el anticuerpo y con las condiciones de la reacción.1,2

Los factores relacionados con el antígeno incluyen el número de sitios antigénicos, las interacciones génicas, la dosis, el sitio que ocupa el antígeno sobre la superficie eritrocitaria, la edad de las células y las condiciones de almacenaje de estas. Entre los factores relacionados con el anticuerpo se encuentran la capacidad para fijar el complemento, la influencia que sobre la reacción tienen el uso de suero o plasma, el fenómeno de rouleaux y la contaminación bacteriana.2

Las condiciones de la reacción incluyen el pH, la relación entre la concentración de antígeno y anticuerpo, la temperatura, el tiempo de incubación, la centrifugación, la fuerza iónica y por último, el tipo de medio, es decir, si para la reacción se utiliza un medio salino, albuminoideo, enzimático o se usa el reactivo antiglobulínico.2

Reacción antígeno-anticuerpo en inmunohematología

La alteración antígeno-anticuerpo puede verse en diferentes contextos; uno de estos es la reacción de aglutinación de los eritrocitos, que se discutirá a continuación, pues es el fenómeno que por lo general ocurre en la mayoría de las técnicas que se realizan en Inmunohematología.

Existen 2 requisitos para que la reacción antígeno-anticuerpo se produzca: uno es la adecuada complementariedad de encaje, podrán unirse a los anticuerpos solo aquellos antígenos con determinantes antigénicos que se ajusten al sitio de combinación del anticuerpo. El otro requisito es la complementariedad de carga, las cargas opuestas de antígenos y anticuerpos crean fuerzas de atracción, mientras que cargas iguales crean fuerzas de repulsión.3,4

Una vez que se forma el complejo antígeno-anticuerpo, las fuerzas que lo mantienen unido no son interacciones covalentes, son interacciones interatómicas débiles que mantienen al antígeno y al anticuerpo en un contacto muy cercano, capaz de desarrollar fuerzas que estabilizan la unión del complejo como las interacciones iónicas, puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas.4

Los anticuerpos aglutinan a los eritrocitos en 2 etapas: en la primera el anticuerpo se une físicamente al antígeno en los eritrocitos (sensibilización), en la segunda los eritrocitos, a los cuales los anticuerpos se unieron, aglutinan formando puentes entre ellos para crear una estructura de enrejado que constituye la aglutinación. En algunas reacciones antígeno-anticuerpo las 2 etapas ocurren casi simultáneamente, mientras que en otras sólo ocurre la primera etapa de la reacción, es decir, hay sensibilización de los eritrocitos por anticuerpos no aglutinantes.3

Para analizar la reacción de aglutinación es conveniente separarla en sus 2 etapas, ya que existen factores y variables que afectan a cada una.

Primera etapa de la reacción de aglutinación

La asociación y disociación del complejo antígeno-anticuerpo se rige por la ley de acción de masas, esta es una reacción reversible:

 

 

donde antígeno-anticuerpo y antígeno-anticuerpo son las concentraciones del antígeno, anticuerpo y complejo antígeno-anticuerpo respectivamente, k1 es la cons-tante de asociación y k2 la de disociación. De acuerdo con la ley de acción de masas:3,5

 

 

K es la constante de equilibrio o afinidad de la reacción y refleja la fuerza de unión entre el antígeno y el anticuerpo. Mientras mayor sea K la velocidad de asociación de la reacción será mayor, es decir, serán mayores las cantidades que se formarán del complejo antígeno-anticuerpo y la velocidad de disociación será más lenta.3,5

La constante de equilibrio K en la reacción de aglutinación se afecta por las concentraciones de antígeno y anticuerpo, y por condiciones físicas de las técnicas tales como pH, temperatura, fuerza iónica y tiempo de incubación. La alteración de estas últimas condiciones puede producir aumento o disminución de la sensibilidad en la aglutinación.3,5

Concentración de antígeno y anticuerpo: la velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo varía con el número de moléculas de anticuerpo presentes en el medio y con el número de sitios antigénicos presentes en cada célula. Al aumentar la cantidad de anticuerpos en el medio puede aumentar la sensibilidad de la prueba, asimismo, al aumentar la proporción suero/eritrocitos se proveen más anticuerpos por zonas antigénicas.5-7

PH: el pH óptimo para los anticuerpos de la mayoría de los sistemas de grupos sanguíneos aún no ha sido determinado. Anticuerpos como los anti-M reaccionan mejor a pH bajo, y para los anti-D se reporta el pH óptimo entre 6,5 y 7,0. En la práctica las técnicas de rutina deben trabajarse a un pH alrededor de 7,0.5

Temperatura: la mayoría de los anticuerpos de grupos sanguíneos reaccionan en un rango restringido de temperatura. Por ejemplo, los anti-P reaccionan ópticamente a 18 °C y los anti-Fya a 37 °C. Los anticuerpos de la clase IgM son más reactivos a bajas temperaturas (4-27 °C), mientras que los de la clase IgG lo son a 37 °C. Por este motivo, las técnicas de detección de anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 22-37 °C ó 30-37 °C.7-9

Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37 °C, no se consideran clínicamente significativos y rara vez destruyen eritrocitos transfundidos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el complemento a temperaturas por debajo de 30 °C, pero sólo acortan de forma mínima la supervivencia de eritrocitos incompatibles transfundidos. Los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que tienen actividad in vivo que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 °C.

Fuerza iónica: en una solución salina normal los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las moléculas de antígeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas opuestas. Este recubrimiento dificulta la unión del anticuerpo con el antígeno y se reduce al disminuir la fuerza iónica del medio donde tiene lugar la reacción, por lo general cuando la concentración salina del medio de reacción disminuye, la velocidad de captación del anticuerpo aumenta.3,5

Tiempo de incubación: los anticuerpos de los diversos grupos sanguíneos tienen diferentes tiempos para alcanzar el equilibrio, en esto interviene de manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en que se une con antígeno específico.7

Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solución salina han demostrado que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan, aproximadamente el 25 % lo hace en los primeros 15 minutos y el 75 % restante lo hace durante la primera hora. La adición de varios agentes potenciadores, por ejemplo disminución de la fuerza iónica, puede aumentar la cantidad de anticuerpos fijados durante los primeros 15 minutos, y con esto disminuir el tiempo de incubación necesario para alcanzar el equilibrio.5,7,10

Segunda etapa de la reacción de aglutinación

Una vez que la reacción antígeno-anticuerpo ha ocurrido, la aglutinación puede o no producirse. Algunos factores permiten la aglutinación, otros la impiden, estos son: características del anticuerpo, localización y número de sitios antigénicos, fuerzas que mantienen la distancia entre los eritrocitos, uso de albúmina sérica bovina, uso de enzimas, efecto de dosis y efecto de moléculas con carga positiva.5,7

Característica del anticuerpo: 2 de las características de los anticuerpos que deben considerarse son el tamaño y el número de sitios de combinación con el antígeno, ya que entre los anticuerpos de las clases IgG e IgM existen considerables diferencias físicas.

Los anticuerpos IgM pueden establecer puentes entre los eritrocitos y aglutinarios aún suspendidos en solución salina, mientras que los anticuerpos IgG no. Esto es posible porque las moléculas de IgM son circulares y poseen 10 sitios de combinación con el antígeno, separados a una distancia de 300 Å; la distancia que separa a 2 células normales es 184 Å y estos anticuerpos para provocar la aglutinación de las mismas pueden combinar 2 ó 3 de sus sitios con una, y el resto de los sitios con otra.1,11

Las moléculas de IgG, a diferencia de las IgM, poseen sólo 2 sitios de combinación con el antígeno y estos están separados a una distancia de 140 Å, por lo tanto, para aglutinar 2 células sólo dispone de un sitio de combinacion para cada una, estos a su vez se encuentran más cercanos uno del otro que los sitios de la IgM.1,3,4,11

Localización y número de sitios antigénicos: los reactivos hemoclasifica-dores anti-A y anti-B de tipo IgG regu-larmente aglutinan eritrocitos de estos fenotipos suspendidos en solución salina. Una posible explicación para este fenómeno es la localización y número de los antígenos del sistema de grupos sanguíneos ABO. Existe gran cantidad de sitios antigénicos A y B en los eritrocitos, comparado con el número de sitios de otros antígenos, además los antígenos A y B están localizados en los glicolípidos y zonas sobresalientes de la superficie de la membrana. Otros antígenos como el RhD son proteínas localizadas en la propia membrana eritrocitaria.5,7,12

Fuerzas que mantienen la distancia entre los eritrocitos: como se analizó anteriormente, los eritrocitos sensibilizados con anticuerpos de la clase IgM pueden crear la estructura de enrejado en la segunda etapa de la reacción de aglutinación, porque los anticuerpos de esta clase son capaces de cubrir la distancia que separa a los eritrocitos entre sí por la repulsión de cargas iguales.

De forma contraria, los anticuerpos de la clase IgG son generalmente sensibilizantes, pero no aglutinantes. El ser moléculas de pequeño tamaño y con 2 sitios de combinación con el antígeno, les imposibilita vencer la distancia que existe entre los eritrocitos y aglutinarlos. Los eritrocitos tienen una carga neta negativa en su superficie, su interacción con los iones del medio en que están suspendidos altera esa carga y producen una carga neta denominada potencial zeta, de ahí que la distancia que separa a los eritrocitos es proporcional al potencial zeta y la disminución de esta hace que los eritrocitos se aproximen y puedan ser aglutinados por anticuerpos de esta clase.5,7,13

Uso de albúmina sérica bovina: los anticuerpos que no aglutinan eritrocitos suspendidos en solución salina, en ocasiones, los aglutinan cuando están suspendidos en albúmina bovina, esto es posible porque la albúmina provoca un incremento en la constante dieléctrica del medio en el que están suspendidos los eritrocitos y una disminución del potencial zeta. La constante dieléctrica de un medio es una medida de su habilidad para disipar cargas.1,5,14,15

No todos los anticuerpos de los grupos sanguíneos aumentan su actividad en las pruebas de albúmina. Los anti-A, anti-B y anti-Lewis muestran reducción de su actividad en presencia de albúmina; este influye en el grado de hidratación de la membrana, lo cual puede alterar la orientación estérica del determinante antigénico o puede disminuir la entropía disponible para dirigir la reacción.1

Uso de enzimas: enzimas proteasas como la bromelina, tripsina, papaína y ficina se utilizan en las pruebas serológicas porque reducen la carga de la superficie de los eritrocitos al hidrolizar las sialoglicoproteínas de la superficie celular. La neuraminidasa también reduce la carga de la superficie celular porque escinde moléculas de ácido siálico N-acetilneu-ramínico (NeuNAc) de las cadenas de polisacáridos.14,16,17

Como se discutió anteriormente, cualquier mecanismo que elimine las cargas negativas de los eritrocitos reducirá la distancia que los separa al disminuir el potencial zeta y así facilitar su aglutinación por parte de anticuerpos de la clase IgG. Se conoce que este proceder puede disminuir la distancia entre células de 184 Å a 113 Å en eritrocitos tratados con papaína, y a 111 Å cuando son tratados con neuraminidasa.1 El tratamiento enzimático de eritrocitos también incrementa la accesibilidad de algunos antígenos cuando las glicoproteínas son eliminadas.

Los eritrocitos pretratados con neuraminidasa aumentan su aglutinación por efecto de moléculas de IgG, pero este aumento no es comparable al producido por otras enzimas.14,17

Además de estas acciones, las enzimas proteolíticas eliminan zonas antigénicas de otros anticuerpos como anti-M, -N, -S17, -Fya y -Fyb.1,5 Esta propiedad de las enzimas proteolíticas son de gran utilidad en la identificación de anticuerpos eritrocitarios.

Efecto de dosis: el efecto de dosis es una vía por la que algunos antígenos pueden afectar la fuerza de la reacción antígeno-anticuerpo. Algunos anticuerpos muestran diferencias en la fuerza de sus reacciones, en dependencia de la cantidad de antígeno presente en las células. A veces estas cantidades son proporcionales al genotipo del individuo, por ejemplo, los eritrocitos M+ de un individuo de genotipo MM contienen más antígeno M que los eritrocitos M+ de un individuo de genotipo MN.1,5

Efecto de moléculas con carga positiva: el Polibreno® es un polímero de carga positiva, provoca agregación espontánea de eritrocitos normales al neutralizar su carga superficial negativa producida por el ácido siálico. Las células carentes de NeuNAc, por ejemplo, las células poliaglutinables T o Tn y las tratadas con proteasa, no se agregan en presencia de PolibrenoÒ, lo cual ofrece información adicional sobre las características físicas de la reacción de aglutinación.1,5,14

Detección e identificación de anticuerpos eritrocitarios

El pesquisaje de anticuerpos eritrocitarios tiene como objetivo detectar y luego identificar anticuerpos clínicamente significativos, que puedan causar reacción transfusional y acortamiento de la sobrevida normal de los eritrocitos, de modo que deben emplearse métodos in vitro apropiados.

Usualmente se emplean múltiples técnicas para la detección de anticuerpos eritrocitarios, una de ellas es el tratamiento enzimático de los eritrocitos con proteasas. Esta técnica es mucho más sensible que otras en las que no se utilizan eritrocitos pretratados enzimáticamente, especialmente en la detección de anticuerpos Rh y otros anticuerpos que sólo reaccionan ante eritrocitos pretratados.18

A pesar de las ventajas que brinda el uso de enzimas proteolíticas, es importante alertar en relación con su uso como rutina en la detección de anticuerpos eritrocitarios. Los eritrocitos pretratados con enzimas pueden detectar anticuerpos fríos y otros anticuerpos que no son clínicamente significativos, además existe muy poca correlación entre la presencia pretransfusional de anticuerpos detectables únicamente por métodos enzimáticos, y el desarrollo de anticuerpos demostrables por otros métodos, días o semanas después de la transfusión.1,19

Dos de las técnicas que deben emplearse como rutina en la evaluación de anticuerpos eritrocitarios son: el método del polibreno y el de LISS (del inglés low ionic strength solution, solución de baja fuerza iónica). Estos métodos consumen menos tiempo, dinero y esfuerzo que los métodos enzimáticos.20-23 Es necesario comentar que la técnica del LISS sólo debe realizarse a 37 °C, ya que a temperatura ambiente se pueden detectar anticuerpos que no tienen repercusión clínica.1

De forma contraria, el método del polibreno se realiza a temperatura ambiente y tiene como ventaja el detectar predomi-nantemente anticuerpos que son activos a 37 °C por otros métodos. En la técnica de polibreno el tiempo de incubación debe ser el mínimo, para no detectar anticuerpos fríos sin significación clínica.20

La prueba de antiglobulina indirecta (PAI) emplea anticuerpos contra las globulinas humans (AGH) denominado reactivo antiglobulínico poliespecífico (anti-IgG y anti-C3) y eritrocitos suspendidos en solución salina. Esta técnica se realiza en 2 pasos y es la más recomendada para la detección de anticuerpos que sensibilizan eritrocitos que portan su antígeno, pero que no producen aglutinación de las células.24

La PAI es un proceder altamente favorecido por la mayoría de los investigadores que se desempeñan en esta especialidad y no sólo es útil para detectar e identificar anticuerpos, sino que también se utiliza para tipificar la sangre y en las pruebas de compatibilidad.

Este proceder se rige por los siguientes principios: 1. Todas las moléculas de anticuerpos son globulinas; 2. Al inyectar un animal con globulinas humanas este genera anticuerpos contra la proteína extraña, luego el suero animal es adsorbido para eliminar las aglutininas indeseadas y reacciona específicamente con las globulinas humanas; 3. Los 2 sitios Fab de la molécula AGH se unen a las porciones Fc de 2 anticuerpos sensibilizantes que se encuentran en 2 células adyacentes, esta unión forma un puente entre los eritrocitos y la aglutinación se hace visible;4. La AGH reacciona con globulinas humanas unidas a eritrocitos o libres en el suero, estas últimas se unen preferentemente con la AGH, la neutralizan y ocasionan un resultado falsamente negativo, por ello los eritrocitos deben lavarse previamente a la adición del reactivo AGH.5

A finales de la década de los 80 se desarrolló un nuevo método para el tipaje de grupos sanguíneos y para la detección e identificación de anticuerpos eritrocitarios. La prueba de aglutinación en gel es un método de serología transfusional, donde la reacción entre anticuerpos y antígenos ocurre en el gel Sephadex contenido en los microtubos de una tarjeta plástica, la centrifugación se realiza en una centrífuga no convencional y el gel empleado puede ser neutro, contener reactivo AGH para la PAI o reactivos hemoclasificadores de grupos sanguíneos para tipificar la sangre.7,25-28

La prueba de aglutinación en gel es negativa si después de la centrifugación los eritrocitos no aglutinados van al fondo del microtubo al pasar fácilmente a través del gel; los eritrocitos aglutinados quedan atrapados en el gel y forman diferentes patrones de aglutinación. Esta técnica es fácil, sensible y reproducible; entre sus ventajas están el uso de eritrocitos no lavados para la ejecución de la prueba de antiglobulina, requiere pocas cantidades de reactivos, después que la reacción ocurre en el gel esta puede mantenerse sin cambios hasta pasadas 24 horas y los resultados en los microtubos se pueden fotocopiar.7,25,28

Las pruebas de detección de anticuerpos tienen como objetivo evidenciar la mayor cantidad posible de anticuerpos con significación clínica, para lo cual los eritrocitos que se utilicen deben portar los antígenos, contra los cuales están dirigidos la mayoría de los anticuerpos que se encuentran comúnmente. Para investigar los sueros de los pacientes son suficientes 2 muestras testigo de eritrocitos de donantes de fenotipo seleccionado (tabla 1).

Tabla 1. Fenotipos testigos para la detección de anticuerpos eritrocitarios

 
Sistemas de grupos sanguíneos
 

Rh



MN

Lutheran
P
Lewis
Kell
Duffy
Kidd
*
 















Kp

Kp







Muestras
D
C
CW
E
c
e
M
N
S
s
Lua
Lub
P1
Lea
Leb
K
k
a
b
Jsa
Jsb
Fya
Fyb
Jka
Jkb
Xga
1
+
+
0
0
0
+
0
+
0
+
0
+
+
0
+
+
+
0
+
0
+
0
+
+
+
+
2
+
0
0
+
+
0
+
0
+
+
+
+
+
+
0
0
+
0
+
0
+
+
+
+
0
+

* Ligado al sexo.

La detección in vitro de la reacción antígeno-anticuerpo en todas las técnicas que se han comentado hasta aquí se evidencia por aglutinación, sin embargo, existen otras formas de detectar esta reacción, por ejemplo las pruebas de inhibición de la aglutinación, en las que se detecta la presencia del antígeno o del anticuerpo cuando la aglutinación previamente observada de un elemento queda inhibida. Otros medios de detección son sencillos, como la hemólisis; otros como el radioinmunoanálisis son más peligrosos, costosos y complejos.5

La hemólisis es la ruptura de los eritrocitos con la consiguiente liberación de la hemoglobina intracelular, cuando es mediada por anticuerpos requiere el concurso del complemento y no se produce si el plasma contiene un agente quelante del calcio o magnesio. Si la hemólisis se produce, el sobrenadante se torna color rosa tras la incubación de los anticuerpos con los eritrocitos, resultado que se considera positivo.3 Los anticuerpos anti-Lea pueden provocar la hemólisis de eritrocitos suspendidos en solución salina.7

Otra de las técnicas utilizadas para identificar antígenos o anticuerpos es la prueba de adherencia de eritrocitos en fase sólida, que utiliza eritrocitos indicadores. En la prueba directa se recubren las paredes de una microplaca con anticuerpos y se añaden eritrocitos a los pocillos, si tienen el antígeno adecuado se adherirán a los anticuerpos en la pared del pocillo, si no hay reacción antígeno-anticuerpo sedimentan en el fondo del pocillo. En la prueba indirecta se adhieren eritrocitos a los bordes de los pocillos mediante pretratamiento con glutaraldehído, formaldehído o un anticuerpo monoclonal potente, luego se añade suero del paciente y después eritrocitos recubiertos con IgG (células indicadoras). En la reacción positiva los eritrocitos recubiertos se adhieren a las paredes del pocillo, en la negativa los eritrocitos sedimentan en el fondo de los pocillos.29,30

Cuando se detecta un anticuerpo en el suero de un individuo este debe identificarse para conocer su significado clínico, el procedimiento emplea un panel eritrocitario de fenotipo conocido. En dependencia de si las células reaccionan o no con el suero, se podrá reconocer el antígeno contra el cual está dirigido el anticuerpo (tabla 2).

En la tabla 2 se muestra el ejemplo de un suero que reacciona en la PAI con todas las células S+ y no reacciona con la S-. En este caso el suero contiene anticuerpos anti-S y se pueden excluir otras posibilidades, por ejemplo: las células 2, 4 y 10 son D+ y reaccionan con el suero; las células 1,5,6,7 y 8 son D- y no reaccionan con el suero, pero los anticuerpos no pueden ser anti-D porque las células 3 y 9 son D+ y el suero no reacciona con ellas.

Tabla 2. Panel eritrocitario para la identificación de anticuerpos eitrocitarios

 
MN
Lutheran
P
Lewis
Kell



Duffy
Kidd *
Resultado
 





















PAI
Muestras
Rh
M
N
S
s
U
Lua
Lub
P1
Lea
Leb
K
k
Kpa
Kpb
Jsa
Jsb
Fya
Fyb
Jka
Jkb
Xga

1
CCddee
+
+
0
0
0
0
+
+
0
0
0
+
0
+
0
+
0
0
0
+
+
0
2
CcwDee
0
+
+
+
0
0
+
+
+
0
0
+
0
+
0
+
+
+
+
+
+
2+
3
CCDee
+
+
0
+
0
+
+
0
0
+
0
+
0
+
0
+
0
+
+
+
+
0
4
ccDEE
+
0
+
0
0
0
+
+
0
+
+
+
0
+
0
+
+
0
+
+
0
3+
5
ccddEE
+
0
0
+
0
0
+
+
0
+
0
+
0
+
0
+
0
+
0
+
+
0
6
ccddee
0
+
0
+
0
0
+
+
0
0
0
+
0
+
0
+
0
0
+
0
+
0
7
ccddee
+
+
0
+
0
0
+
0
+
0
0
+
0
+
0
+
+
0
0
+
+
0
8
ccddee
+
+
0
+
0
0
+
+
0
+
+
+
0
+
0
+
0
+
+
+
+
0
9
CCDEe
+
0
0
+
0
0
+
+
0
+
0
+
0
+
0
+
+
0
0
+
+
0
10
CcDee
+
0
+
0
0
0
+
0
0
+
0
+
0
+
0
+
0
+
+
0
+
3+

* Ligado al sexo.

Al investigar, de esta manera, se pueden excluir otros anticuerpos, es decir otras especificidades; otros no pueden ser descartados. En el ejemplo anterior el suero puede presentar anticuerpos anti-Cw tanto como anti-S, porque el suero reacciona con la célula 2 y esta es S+ y Cw; en este particular y en otros similares es necesario el uso de un fenotipo extra S-, Cw +.

Cuando el suero contiene diferentes tipos de anticuerpos se deben utilizar diferentes vías para determinar las especificidades presentes, una de ellas es valorar la fuerza de la aglutinación con cada fenotipo del panel eritrocitario, otra es el tratamiento enzimático de los eritrocitos para eliminar los sitios antigénicos de los antígenos Fya, Fyb, M, N y S. También se puede usar más de una técnica para identificar varias especificidades si nos basamos en el hecho de que muchos anticuerpos reaccionan por diferentes métodos.7

La identificación de anticuerpos contra antígenos de baja o alta incidencia, se rige por los mismo principios detallados anteriormente para otros anticuerpos, pero sólo se requiere el uso de fenotipos raros. Estas células, digamos exóticas, no poseen antígenos de alta incidencia, o por el contrario, portan algunos de estos antígenos raros.

En otras ocasiones los métodos de adsorción elución son útiles para la identificación de anticuerpos eritrocitarios, por ejemplo un suero que contiene anti-K producido por un individuo de fenotipo RhD- se debe estudiar para dilucidar la presencia de anticuerpos anti-D, si la muestra de eritrocitos D+, K-es insuficiente para confirmar o excluir la presencia del anti-D, el suero se puede adsorber con células D-, K+ repetidamente, cuando se obtiene el suero libre de anti-K+ este se enfrenta a muestras D+ y D-, si el anti-D está presente el anti-K se puede separar de ese anticuerpo por elución de los eritrocitos D-, K+ ad-sorbidos.

En los últimos años se han producido muchos avances en la Inmunohematología, la medicina transfusional y las disciplinas relacionadas. Los procederes de detección e identificación de anticuerpos eritrocitarios son diversos y mucho más sofisticados y complejos que como se trataron en este trabajo, no obstante, se intentó hacer una revisión de un tema amplio que va en continuo desarrollo y perfeccionamiento para aumentar la cultura inmunológica de nuestros lectores.

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Inmunología: Reacciones Antígeno Anticuerpo

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REACCIONES ANTIGENO ANTICUERPO

 

 

En las reacciones antígeno-anticuerpo se distinguen 2 fases: la primera consiste en la unión del antígeno con el anticuerpo y la segunda en las manifestaciones que resultan de dicha unión. La primera fase se realiza por la combinación de áreas pequeñas tanto del antígeno como del anticuerpo, denominadas respectivamente determinante antigénico y sitio activo, que al unirse forman un complejo antígeno-anticuerpo.

Reacción de precipitación

La reacción de precipitación ocurre cuando se combina un anticuerpo, por lo menos di- valente, con un antígeno soluble y esto conlleva a la formación de agregados que precipitan. Para que la precipitación ocurra en forma máxima se necesita que tanto el antígeno como el anticuerpo estén en concentraciones óptimas, cuando cualquiera de los reaccionantes están en exceso no se pueden formar grandes agregados antígeno-anticuerpo.

En este caso el antígeno se encuentra disuelto, y al unirse los anticuerpos a los antígenos se forman unos macrocomplejos moleculares, formándose como una red tridimensional que debido a su tamaño precipita.

Aglutinación

En las reacciones de aglutinación, un anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, asímismo cada antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar un entramado de complejos antígeno-anticuerpo.

Cuando un antígeno particulado reacciona con su anticuerpo específico (divalente por lo menos) se observa la formación de grumos o agregados de estas partículas, esto se cono- ce como aglutinación. En estas reacciones el determinante antigénico está sobre la su- perficie de una partícula o de una célula.

Estas reacciones son más sensibles que las de precipitación para detectar pequeñas canti- dades de anticuerpos, debido a que relativamente pocas moléculas de anticuerpo pueden unir efectivamente un gran número de partículas de antígeno en grumos gruesos macroscópicamente visibles.

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Inmunología: Interacciones Entre Antígeno y Anticuerpo

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Interacciones Entre Antígeno y Anticuerpo

Antes de tratar sobre los detalles de las reacciones antígeno-anticuerpo, se recomienda el repaso de los siguientes conceptos: 

 

antígeno
epitopo (determinante antigénico)
hapteno y conjugados hapteno-portador
experimentos de Landsteiner, que demuestran el papel clave de la configuración global del hapteno: lo que reconoce el Ac es la nube tridimensional de la capa externa de electrones del hapteno
anticuerpos: el sitio de unión con el antígeno está formado por el conjunto de las seis CDR. Este conjunto interacciona con el epitopo, y es lo que se denomina paratopo
la cristalografía de rayos X demuestra la complementariedad (de tipo llave-cerradura) entre el paratopo y el epitopo
flexibilidad en la unión: puede darse un ajuste inducido en una CDR al unirse al correspondiente grupo químico del epitopo, permitiendo un mejor encaje molecular entre ambos.

CARACTERÍSTICAS FÍSICOQUÍMICAS DE LA UNIÓN Ag-Ac

La unión Ag-Ac es una interacción reversible en la que sólo intervienen enlaces no-covalentes entre el epitopo del Ag y las CDRs de la pareja VH-VL del Ac. 

Fuerzas implicadas en la unión Ag-Ac

Los enlaces no covalentes son dependientes de la inversa de la distancia entre los grupos químicos implicados.

Puentes de hidrógeno
Fuerzas electrostáticas (enlaces iónicos)
Fuerzas de van der Waals 
Enlaces hidrófobos

La clave de la unión está en la complementariedad entre Ag y Ac: si ésta es buena, se produce la exclusión de agua, lo que permite un acercamiento estrecho entre epitopo y paratopo, lo que determina altas fuerzas de unión. 

Afinidad

La afinidad de un anticuerpo(Ac) concreto (p. ej., cuando usamos un anticuerpo monoclonal) por un epitopo (H) es la suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas entre un sitio de unión de ese anticuerpo y el correspondiente epitopo. Ello se puede definir a través de la correspondiente constante de equilibrio (K), según la ley de acción de masas:

siendo [Ac] la concentración de sitios libres de Ac y [Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac.

La determinación de la constante de afinidad K se realiza en experimentos de diálisis, que conducen a la determinación de la ecuación de Scatchard:

Avidez

Es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los determinantes individuales de ese antígeno, su valor es mucho mayor que la suma de afinidades.

Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales suelen tener más de un tipo de determinante antigénico. Cuando un antígeno de este tipo entra en un individuo, éste produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un tipo diferente de determinante antigénico del Ag original. En esta caso se habla de avidez del antisuero, que es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero que reconocen al antígeno multivalente complejo:

n Ac + mAg ß à {Acn Agm},

donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del antígeno.

Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy interesante es el derivado de la multivalencia del antígeno. La fuerza de unión de un antígeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma aritmética de las fuerzas de unión de cada anticuerpo:

La avidez refleja mejor la situación fisiológica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo concreto en su interacción con el epitopo.

CINÉTICA DE LAS REACCIONES Ag-Ac

Parece que existen indicios de que durante la maduración de la respuesta humoral de producción de anticuerpos se produce no sólo una selección de anticuerpos con mayor afinidad (selección termodinámica), sino con mayor rapidez (selección cinética).

SITIOS DE UNIÓN POLIFUNCIONALES

Puede darse el caso de que una misma molécula de anticuerpo pueda ser complementaria de varios determinantes antigénicos distintos. En este caso, la unión de cada epitopo al anticuerpo es competitiva, aunque existen lugares distintos para cada epitopo dentro del paratopo del anticuerpo.

Cuando inducimos una respuesta humoral frente al Ag "A", se produce una población de Ac polifuncionales, que tienen en común el tener un sitio para "A" (aunque en dicha población se dan subpoblaciones, que, además podrían reconocer parte de otros Ag). La reactividad neta del antisuero es alta frente a "A" (el Ag inductor), pero baja frente a los demás Ag.

 

 

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Inmunología: Receptor Células T

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 Receptor Células T

Los linfocitos T,  presentan un mecanismo de reconocimiento antigénico distinto de los linfocitos B. En el caso de los linfocitos T, el antígeno endógeno o exógeno es primero degradado y procesado en el interior de las células presentadoras de antígeno (APC). Posteriormente, sus determinantes antigénicos procesados son expuestos en la superficie de la APC, en el seno de una molécula del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC de clase I o de clase II). El linfocito T, a través de su receptor clonotípico, únicamente reconoce al antígeno cuando éste se encuentra presente en la membrana de la célula presentadora de antígeno.

 Asociados a las dos cadenas polipeptídicas polimórficas (alfa y beta o gamma y delta) que constituyen las dos variantes del TCR, se encuentra un grupo de moléculas monomórficas de membrana llamado colectivamente CD3, formando así el complejo TCR/CD3 (Figura 7.1). Cuando tiene lugar el reconocimiento antigénico entre el TCR y la molécula MHC que porta el antígeno, se desencadena una cascada de reacciones bioquímicas en el citoplasma de la célula T, dando así lugar al proceso de activación.

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ESTRUCTURA DEL COMPLEJO TCR/CD3   

Mediante la utilización de híbridos se determinó que el reconocimiento del antígeno y de la molécula MHC se lleva a cabo simultáneamente por un mismo TCR/CD3 auque cada una de las moléculas que lo componen tienen diferentes funciones.

 Componentes del complejo TCR/CD3

El complejo TCR/CD3 consta de dos partes bien diferenciadas, tanto estructural como funcionalmente (Figura 7.2):

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  • TCR. Heterodímero con dos subunidades protéicas, denominadas alfa y beta, unidas covalentemente por puentes disulfuro. Es la porción específica del receptor, por lo tanto polimórfica, y en ella se dá la variación clonotípica que va a permitir el reconocimiento de los más de 108 antígenos diferentes. Existe una variante del TCR que se encuentra en unas pocas células T, y está formada por cadenas gamma  y delta en lugar de las cadenas alfa y beta. Este heterodímero no se asocia covalentemente, y su función aún no está claramente determinada
  • CD3. Es la porción invariante del complejo y está formado por al menos 3 monómeros unidos no covalentemente, denominados gamma, delta y epsilon.  El complejo CD3 fue descubierto por anticuerpos monoclonales, OKT3 y Leu4, y sus secuencias nucleotídicas se averiguaron alfa partir del análisis de  cDNA. Es el encargado de transmitir la señal del reconocimiento antigénico al interior celular. Al complejo CD3 se le asocia un gran homodímero intracitoplasmatico zz.

Todos los componentes del receptor de la célula T son proteínas de membrana, y están formadas por una secuencia, dominio N-terminal extracelular, dominio transmembrana y dominio citoplásmico C-terminal.

Estructura bioquímica del receptor clonotípico (TCR)

Cadena  TCR-alfa.

Es una cadena glicosilada ácida que esta divida en los siguientes dominios (Figuras  7.3; Figura 7.4  y Tabla 7.1):

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TABLA 7.1

Estructura del complejo TCR-CD3 

Molécula

PM

Cromo-

soma

Número aminoácidos

Extraci-

toplasma

Trans-

membrana

Intraci-

toplasma

 

TCR-alfa

TCR-beta

CD3-delta

CD3-epsilon

CD3-gamma

CD3-zeta

 

 

46

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20

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25

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14

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11

11

1

 

 

222

255

79

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21

26

25

25

26

21

 

5

5

43

59

44

112

  • Un péptido líder.
  • Un dominio extracelular, constituido por una región variable parecida a la de las inmunoglobulinas y con 2 cisteínas implicadas en los puentes disulfuro;   una región de unión  y una región constante que también contiene 2 cisteínas implicadas en puentes disulfuro intracatenarios
  • Un dominio transmembranal, donde es particularmente significativo la presencia de   dos cargas de aminoácidos básicos implicados, probablemente, en el puente de unión  de tipo salino con las cadenas del complejo CD3  
  • Un dominio intracelular de tan sólo 5 aminoácidos.

Cadena  TCR-beta.

Es una cadena glicosilada  con estructura similar a la ya mencionada TCR-alfa. Consta de un péptido leader y tres dominios diferentes (Figura  7.3; Figura 7.4  y Tabla 7.1).

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TABLA 7.1

Estructura del complejo TCR-CD3 

Molécula

PM

Cromo-

soma

Número aminoácidos

Extraci-

toplasma

Trans-

membrana

Intraci-

toplasma

 

TCR-alfa

TCR-beta

CD3-delta

CD3-epsilon

CD3-gamma

CD3-zeta

 

 

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5

5

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112

  • Extracelular, con una región variable, una de unión y otra constante que posee 4 cisteínas
  • Transmembranal, región hidrofóbica con un residuo básico de Lisina para crear un puente salino con las unidades de CD3.
  •  Intracelular, formada también por sólo 5 aminoácidos.

Es conocido como la estructura de las cadenas alfa y beta  guardan una cierta homología secuencial con los dominios de las inmunoglobulinas.

Estructura bioquímica del complejo CD3

Cadena CD3-delta.

CD3-delta es una glicoproteína constituida por tres dominios bien diferenciados: a) dominio extracelular, que lleva dos oligosacáridos unidos; b) un dominio transmembranal, y c) un dominio intracitoplasmático (Tabla 7.1 y figura 7. 5).

 

TABLA 7.1

Estructura del complejo TCR-CD3 

Molécula

PM

Cromo-

soma

Número aminoácidos

Extraci-

toplasma

Trans-

membrana

Intraci-

toplasma

 

TCR-alfa

TCR-beta

CD3-delta

CD3-epsilon

CD3-gamma

CD3-zeta

 

 

46

40

20

20

25

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14

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11

11

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222

255

79

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89

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21

26

25

25

26

21

 

5

5

43

59

44

112

 

 

Cadena CD3-epsilon.

Es una proteína no glicosilada. Está constituída por tres dominios: a) extracelular, comprendiendo los residuos 1 al 107; b) transmembranal, de marcado caracter hidrofóbico, que comprende los resíduos 105 a 130. Al igual que ocurre en el caso del CD3-delta, aparece un aspártico en posición 115, intuyéndose que está implicado en una función parecida y c) intracelular, constituido por dos porciones cláramente diferenciadas.

Cadena CD3-gamma

Es también una glicoproteína de estructura similar a las anteriores y su función se cree que es fundamentalmente estructural y/o de interacción con otros correceptores (CD2, CD4, CD8, etc.).

Cadena CD3-zeta.

Tiene una estructura distinta de los otros péptidos del complejo CD3, ya que su dominio extracelular es de mucho menor tamaño que el extracelular. Es de gran interés señalar las 6 tirosinas en el dominio intracelular, que se fosforilan cuando el receptor de la célula T se activa. El segmento transmembrana de la cadena z tiene una gran homología con la subunidad g del receptor Fc de la IgE, y es requerido tanto para su expresión como para la transducción de señal (figura 7.6). *****La subunidad zeta se encuentra asociada al TCR en forma de homodímero zz, o, con menor frecuencia, como heterodímero unido a otra proteína, llamada h que proviene del mismo gen que zeta por splicing alternativo.

Dentro del dominio citoplasmático de todas las cadenas que forman el CD3 (g,d,e y en la cadena z) existen unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based  Activating Motif) que son ricas en tirosinas y susceptibles de ser fosforiladas en el proceso de transducción de señales de activación hacia el interior celular.

Estructura del receptor TCR-gamma-delta/CD3

Este tipo de receptor se expresa en una población minoritaria de linfocitos T periféricos que carecen de las moléculas de superficie CD4 y CD8 (también se encuentran en una pequeña proporción de timocitos, en linfocitos de epitelio intestinal y en algunas células dendríticas epidérmicas). La función de este tipo celular no está bien caracterizada, aunque se cree que juegan un importante papel en las enfermedades autoinmunes (se aprecia un aumento del número de este subtipo celular en sangre periférica).

Síntesis y proceso de acoplamiento del complejo TCR/CD3.

Las cadenas peptídicas son sintetizadas en poliribosomas asociados a membrana, y la formación del complejo TCR/CD3 se produce mientras estas moléculas aún residen en el retículo endoplásmico. Las primeras estructuras que se detectan durante este proceso de biosíntesis son CD3. Posteriormente se unen las cadenas alfa y beta. (se ha comprobado que mutantes que carecen de las subunidades alfa y beta no son capaces de expresar el complejo TCR/CD3 en la superficie celular). Por último se produce la unión de la subunidad zeta y la glicosilación en el extremo N terminal de las cadenas alfa y beta del TCR y gamma y d del complejo CD3 (Figura 7.7).

Con estos dos últimos procesos, el receptor está listo para abandonar el retículo endoplásmico y comenzar el mecanismo de exportación, a través del Golgi, a la superficie celular. La maquinaria enzimática que se encuentra en el interior del complejo de Golgi realiza un procesamiento, tanto de las subunidades protéicas como de las cadenas glucídicas unidas a éstas. Este proceso es necesario para que el receptor sea completamente funcional cuando llegue a la membrana celular.

Estequiometría del complejo TCR/CD3

Aunque se conocen los componentes del complejo TCR/CD3, no se ha determinado aún con precisión en qué proporción se asocian para constituir un complejo funcional. Según la hipótesis mas extendida, habría receptores formados por las moléculasabTcRdgeeCD3zz, , pero también podrían existir los receptores con otras isoformas (Figura 7.8). En todos los casos, habría dos sitios de unión al antígeno por complejo, como ocurre con  las inmunoglobulinas.

genética del receptor       

Al igual que ocurre en las inmunoglobulinas, los genes que codifican las cadenas alfa y beta del TCR están formadas a partir de la unión de elementos génicos separados. El reordenamiento génico, tanto de las inmunoglobulinas como del TCR, es dependiente de la presencia de secuencias de DNA específicas adyacentes a los segmentos génicos de reordenamiento. Mediante este proceso se genera una enorme diversidad de receptores.

El gen TCR-alfa

La organización génica de la cadena a  se puede dividir en cuatro regiones (en sentido 3'-5') (Figura 7.9):

  • Una región constante, que se reparte en cuatro exones, y que codifica para la región constante de la cadena (C-alfa)
  • Una serie de segmentos de unión (J)
  •  Segmentos que codifican para las secuencias variables de la cadena V-alfa
  • Entre los segmentos génicos V-alfa y J-alfa se encuentran los genes V(D)J del TCR-delta

El gen TCR-beta

Hay dos genes constantes, usados de forma intercambiable en todos los tipos de células T, denominados C-beta1 y C-beta2, repartidos en cuatro exones que codifican el dominio constante y una porción del péptido de unión, región bisagra y la cisteína de unión entre las cadenas alfa y beta, el dominio transmembrana y la fracción citoplasmática, respectivamente (figura 7.9).

Genes del receptor gamma/delta-TCR

La organización genética de los loci del gamma-TCR, localizado en el cromosoma 7, está constituída por una serie de 14 genes variables, seguido de dos segmentos diferentes de genes J-C. La diversidad de combinaciones generadas es muy limitada. Además, una de las regiones constantes es defectiva y podría eliminar uno de los genes V-gamma, no pudiendo participar como molécula funcional (una característica de la región constante es que en el 2º exón se ha perdido el residuo de cisteína, implicado en la formación del puente disulfuro intercatenario).

Estructura genética del complejo CD3

Los genes que codifican para CD3gamma y CD3delta se encuentran muy próximos en las especies analizadas. En humanos, ambos genes están localizados en el brazo largo del cromosoma 11 y están separados por 1,5 Kb, aproximadamente. El gen CD3delta está constituído por cinco exones . El gen CD3-gamma tiene 7 exones. Las uniones exón-intrón están localizadas en posiciones homólogas en los dos genes, con la excepción de que el gen CD3-gamma contiene los dos exones adicionales. Una característica del gen CD3d es el alto nivel de conservación de la secuencia de nucleótidos situada 1000 bases por delante del codón de iniciación.

El gen CD3-epsilon está constituído por 9 exones, dos de los cuales son inusualmente pequeños. Las características más importantes de estos genes son: a) mediante el estudio comparado de secuencias se ha podido confirmar la relación de estos genes con la superfamilia de las inmunoglobulinas; b) la expresión de los genes CD3 parece estar coordinada y regulada por factores reguladores superpuestos (se ha demostrado mediante la utilización de mutantes, los cuales expresaban las cadenas alfa y beta, pero carecían de todo el complejo CD3) y c) estos genes son transcritos sin promotores TATA, secuencia característica de eucariotas.

 Reordenamiento de los genes del receptor clonotípico

Las secuencias adyacentes a la zona 5' de los segmentos J tienen, en homología a las inmunoglobulinas, determinadas secuencias, formadas por un heptámero y un nonámero, y espaciadores muy conservativas implicados, como señal de reconocimiento, en el reordenamiento somático. Las regiones D también están rodeadas de estas señales de reconocimiento. Gracias a la existencia de regiones espaciadoras en D y J, es posible la asociación D-V ó J-V.

El mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas (Figura 7.10):

  • Formación de loops por secuencias complementarias, lo que origina la recombinación de los genes D y J.
  • El gen V sigue un mecanismo análogo, constituyéndose segmentos funcionales V-D-J. La región V podría asociarse tanto con genes de la región D como con la región J (esto no ocurre en la cadena pesada de las inmunoglobulinas, donde la región V sólo puede hacerlo con la región D).
  • Por último, se produce el agrupamiento de un gen L (secuencia líder) y la región constante, dando lugar al DNA reordenado y completo que habría así creado una especificidad al azar.

 Generación de la diversidad en los genes del receptor

Hay una serie de factores que intervienen en la generación de la diversidad: a) la unión aleatoria de los múltiples segmentos de los genes de la línea germinal; b) la diversidad de unión que resulta de una fusión imprecisa entre los distintos segmentos genéticos, provocando delecciones y adiciones de nucleótidos, dando así origen a una diferencia en el número de aminoácidos; c) la asociación al azar de las subunidades peptídicas que constituyen el receptor (habría 5.000 tipos distintos de cadenas a y más de 500 de cadenas b, que pueden potencialmente formar 2.5 millones de combinaciones TCR V(D) J) y d) la multiplicidad de los genes variables V.

En contraste con las inmunoglobulinas, los genes de TCR no parecen diversificarse mediante mutaciones somáticas de los genes reordenados, posiblemente debido a la necesidad de reconocimiento de la molécula MHC.

FUNCION DEL RECEPTOR CLONOTIPICO     

Las funciones del receptor clonotípico de la célula T son, durante el desarrollo en el timo del linaje T, participar en la selección positiva y negativa, y en la periferia el reconocimiento de antígenos exógenos. Estos fenómenos desembocan en la activación celular, durante la cual se inducen diversos programas funcionales en los linfocitos T: síntesis de factores de crecimiento y de maduración llamados linfocinas, síntesis de perforinas, selección clonal, proliferación celular, etc. En el reconocimiento antigénico, además del receptor clonotípico juegan un papel fundamental otras moléculas de superficie (entre ellas se encuentran CD4, CD8, CD2, CD45) (ver capitulo sobre activación de linfocitos T).  La participación del TCR en la activación de los linfocitos T, será estudiada en el capitulo de activación de linfocitos T, mientras que seguidamente se tratará brevemente la participación de este receptor en el proceso de selección tímica.

Selección intratímica de los linfocitos T

El desarrollo de las células T en el timo, tal como se vio en el capítulo 2, está controlado por el TCR de los timocitos en dos estadios distintos (figura 7.11). Primero, un homodímero TCR-beta asociado al complejo CD3 controla la expansión de los timocitos inmaduros, media la exclusión alélica del locus TCR-alfa, inicia la expresión génica simultanea de CD4 y CD8, e induce la transcripción del locus TCR alfa.

En un segundo estadio, una vez que las células tienen el receptor formado por el heterodímero alfa/beta, la especificidad del TCR intervine controlando  el proceso de maduración de los timoncitos de dos formas: 

  • seleccionando estas celulas  para la maduración cuando reconocen las moléculas MHC de clase I y II de las células del epitelio cortical del timo (selección positiva) o
  • entre las seleccionadas positivamente, entran en una muerte celular programada (apoptosis) cuando sus receptores se unen con alta afinidad a un complejo MHC-péptido endógeno (selección negativa).

En la figura 7.12 se esquematiza el proceso de selección positiva y selección negativa  y en la figura 7.13 la composición celular del timo y principales fases de la selección de timocitos.

Selección positiva  de los linfocitos T.

 En la selección positiva los timocitos se unen mediante su TCR con baja afinidad a las moléculas HLA clase I y II de las células epiteliales del timo en cuyo caso sobreviven mientras que aquellos timocitos que no participan en este tipo de unión mueren por apoptosis. En definitiva estos linfocitos que se seleccionan positivamente son rescatados de su muerte por apoptosis. En este proceso participan también los péptidos propios presentados por las moléculas de histocompatibilidad también propias de cada individuo. En este proceso también participan los receptores CD4 y CD8 de estos timocitos que como sabemos son doblemente positivos (CD4+ y CD8+). Incluso experimentos bloqueando con anticuerpos monoclonales tanto los receptores CD4 como CD8 han demostrado que la participación de uno u otro de estos receptores hace que los timocitos deriven hacia linfocitos T citotóxicos o linfocitos T colaboradores, según que participe el receptor CD8 o CD4 respectivamente. Este tipo de selección se efectúa principalmente en el cortex del timo.

Selección negativa  de los linfocitos T.

Este tipo de selección conduce a la muerte por apoptosis de aquellos timocitos que reconocen con gran avidez mediante su TCR a las moléculas de histocompatibilidad I o II presentes en células dendríticas del timo. En este caso esta demostrado que los péptidos propios presentados por las moléculas HLA son de gran importancia. Este tipo de selección es especialmente importante eliminando aquellos clonos celulares que al reconocer lo propio (HLA más péptidos propios) pueden tener capacidad autoreactiva una vez han madurado. Precisamente al eliminar estas células se evita esto y la posibilidad de desarrollo de enfermedades autoinmunes en el futuro. Es de destacar, como veremos en el capitulo de activación de linfocitos T, que cuando este tipo de unión de alta afinidad se produce en células maduras, en lugar de muerte por apoptois, se produce una activación linfocitaria. Este tipo de selección se efectúa principalmente en la médula  del timo.

 En conclusión con estos dos  procesos se garantiza:

  • la supervivencia selectiva de los linfocitos T capaces de reconocer péptidos sobre las moléculas MHC del individuo en el que tendrán que trabajar (selección positiva)
  • la eliminación de los linfocitos T autorreactivos (selección negativa)

Una vez producida la selección positiva y negativa, las células supervivientes (menos del 2% del total) dejan de expresar uno de los dos correceptores (CD4 o CD8), dando lugar a células CD4+CD8- TCRalfa-beta o  CD4-CD8+ TCRalfa-beta maduras (la regulación de la mutua exclusión de los genes CD4 y CD8 no está aún esclarecida).

Reconocimiento del antígeno por el receptor de la célula T

Una vez en la periferia, el linfocito T tiene la capacidad de migrar a través del cuerpo, adheriéndose tanto funcional como no funcionalmente a distintos tipos celulares, sobre los que reconoce antígenos exógenos. Por otro lado, una célula presentadora de antígeno que ha procesado una proteína antigénica determinada expresará en su superficie celular un largo número de diferentes complejos MHC/antígeno. Los péptidos que son reconocidos por las células T deben tener una estructura secundaria en  a-hélice. Se ha visto que todos los péptidos antigénicos son anfipáticos, con una cara hidrofílica y otra hidrofóbica, pudiendo interaccionar una de las caras con el complejo TCR/CD3 y la otra con la molécula de MHC, respectivamente (Figura 7.14). Por esta razón, el reconocimiento de la asociación MHC/péptido antigénico es un proceso dinámico que incluye un primer paso de complejas interacciones célula-célula, antes de que se produzca un contacto productivo que dé lugar a la activación celular.

 Reconocimiento de superantígenos

Se denominan superantígenos a aquellos antígenos capaces de reaccionar con distintas moléculas MHC de clase II y TCR de un mismo individuo. Pueden ser exógenos (como las toxinas de ciertos estafilococos), si provienen del exterior, o endógenos (como el retrovirus MMTV), si se reproducen en la línea germinal (Figura 7.15).

El reconocimiento del superantígeno se distingue del reconocimiento del péptido antigénico convencional por tres características fundamentales: la especificidad de la célula T a los superantígenos está determinada por la región variable de la cadena beta, siendo independiente de otros componentes del receptor de la célula T; el superantígeno tiene dos sitios de unión, uno para la molécula MHC de clase II, fuera de la hendidura de reconocimiento peptídico, y otro para el TCR, situado en la región Vb fuera del sitio clásico de unión al complejo MHC-antígeno (esta característica hace posible que un mismo superantígeno pueda interaccionar con distintas células del repertorio T).    Como consecuencia del reconocimiento de superantígenos exógenos en periferia, se produce la activación celular y fuerte expansión de las células T implicadas en el reconocimiento.

ENFERMEDADES ASOCIADAS Al COMPLEJO TCR/CD3.   

 Alteraciones de diferente índole del TCR/CD3 pueden dar lugar a enfermedades  a veces de difícil diagnóstico.

Receptor clonotípico: oligoclonalidad y enfermedad

Los linfocitos T constituyen, en condiciones normales, una población policlonal en la que están representados, en proporciones equivalentes, todas las regiones V de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta. Sin embargo, diferencias en la configuración de los genes del receptor clonotípico o en la selección intratímica pueden afectar al repertorio de linfocitos T, existiendo una reducción de determinados clones y un aumento de los niveles de otros. Estas alteraciones pueden detectarse analizando la expresión de las regiones V de las cadenas alfa y beta de estas células, y se ha demostrado que se asocian a ciertas enfermedades autoinmunes como la artritis experimental inducida por colágeno.

Complejo CD3 y transducción de la señal

Se ha descrito diversas enfermedades causadas por deficiencias que afectan de forma selectiva a una o varias moléculas del complejo TCR/CD3 (defectos estructurales), o bien por un defecto en la transmisión de la señal de activación al interior celular (deficiencias funcionales, ya sean primarios o secundarios).

Estas deficiencias producen alteraciones en el sistema inmune: disminución del número de linfocitos, inhibición de la proliferación celular, reducción de la síntesis de citocinas, etc. Las consecuencias clínicas que se derivan de estos defectos son variadas y más o menos graves; sobre todo existen infecciones recurrentes y, a veces, enfermedades autoinmunes.

Defectos estructurales

Hasta el momento se han descrito, en humanos, tres deficiencias que afectan al complejo CD3 o proteínas asociadas a él: CD3-gamma, CD3-epsilon y la PTK Zap-70. En los enfermos con déficit de las cadenas CD3-gamma, CD3epsilon hay una disminución del número de moléculas de membrana del complejo TCR/CD3, el 50% para la deficiencia de CD3-gamma  y un 90% para el CD3-epsilon; este dato sugiere que la cadena e es más importante para la conformación del complejo, y que, como comentamos anteriormente, existirían isoformas del complejo donde las cadenas CD3-gamma y epsilon, que pueden ser alternativas, y suficientes para que CD3 se transporte a la membrana.

Defecto secundarios del  reconocimiento a través del TCR/CD3.

Algunos virus pueden producir efectos patogénicos directos en el sistema inmune por interferir en la transducción de señales por el TCR/CD3. Se ha demostrado que algunos virus infectan células T humanas: virus de inmunodeficiencia humana (HIV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6), measles virus y otros. También se sabe que algunos tumores inducen inmunodeficiencias secundarias de los linfocitos T, probablemente, entre otros factores alteraciones estructurales en el complejo CD3.

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Inmunología: Variabilidad de las Inmoglobulinas

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Variabilidad de las Inmunoglobulinas

Los mecanismos para generar diversidad en las inmunoglobulinas se diferencia en dos tipos, los que ocurren antes del contacto con el antigeno (variabilidad natural) y los que ocurren despues (variabilidad adaptada).

Mecanismos de diversidad natural

Los genes de las Ig se localizan en tres loci, la cadena pesada en el cromosoma 14. la cadena ligera κ en el cromosoma 2 y la cadena ligera λ en el 22.

Estos mecanismos nos proporcionan una variabilidad idiotipica (repertorio) de 1011 idiotipos (especificidades) diferentes de LB, que elaboramos en la médula ósea SIN la presencia del antígeno.

Para la cadena pesada existe un gen para la región variable y cinco para la región constante mu (μ), gamma (γ1, γ2 y γ3), alfa (α1 y α2), epsilon (ε) y delta (δ), una por cada isotipo. Para la cadena ligera κ solo hay un segmento constante, pero para la λ hay al menos seis, aunque funcionalmente iguales.

La cadena pesada (H) de una inmunoglobulina está codificada:

  • dominio variable (VH): por 3 segmentos génicos (exones), VH,DH y JH
  • dominio constante (CH): por 1 segmento génico CH

 

La cadena ligera (L) de una inmunoglobulina está codificada :

  • dominio variable ( VL ): por 2 segmentos génicos, VL y JL
  • dominio constante ( CL ): por 1segmento génico CL

El principal mecanismo para generar la diversidad idiotípica en los receptores para el antígeno es la recombinación del DNA al azar de los segmentos génicos V, D y J, que son los que van a codificar las zonas variables de las cadenas pesadas y ligeras, más concretamente la zona CDR3.

En el cromosoma 14 de nuestras células hay múltiples segmentos génicos VH, DH y JH que permitirán codificar un gran número de diferentes dominios variables en las cadenas H, pero que aún no son operantes: las regiones génicas V, D y J se hallan muy separadas entre sí.

En este mismo cromosomay a la derecha de estas regiones génicas (V, D y J), a gran distancia de ellas y ordenadas de izquierda a derecha, se encuentra la región génica que codifica los dominios constantes de todas las clases y subclases de cadena H (μ, δ, γ, α, y ε).

genes inmunoglobulinas

En el cromosoma 2 hay múltiples segmentos génicos Vk y Jk , que permitirán codificar gran número de dominios variables en las cadenas k,  y una única región génica de dominio constante.

En el cromosoma 22 hay múltiples segmentos génicos Vl y Jl ,que permitirán codificar gran número de dominios variables en las cadenas l.

Dentro de estos cromosomas se encuentran los segmentos para codificar las zonas variables: 75 para V, 27 para D y sólo 6 para J en las cadenas pesadas; las cadenas ligeras únicamente contendrán 2 genes V y J; además hay muchas secuencias (secuencias C) para las zonas constantes de las cadenas pesadas y ligeras.

Reordenamiento de la cadena pesada

Los segmentos que codifican las regiones variables están muy separados en el genoma de todas las células menos en LB, debido a que durante el desarrollo en la medula osea los segmentos VDJ se yuxtaponen por un proceso de b>recombinación somatica.

El DNA inmaduro de la línea germinal se recombina, uniendo primero un segmento al azar de D a un segmento al azar de J y más tarde la secuencia DJ se une a un segmento V cualquiera, también escogido aleatoriamente. A continuación se une esta nueva región genética VDJ a la región génica de los dominios constantes. Este reordenamiento se produce en todas las células Pro-B de manera independiente. La base genética que se genera en este momento se mantiene durante toda la vida celular.

reconvinacion vdj

Al final de estos procesos, si el reordenamiento de genes es exitoso (tiene sentido) la célula sintetiza cadenas μ (pesada) y estas cadenas aparecen en el citoplasma.La célula pasa a estadío Pre-B.

Se llama recombinasa al conjunto enzimático que actúa para producir la recombinación VDJ y VJ. Algunos de estos enzimasposeen actividadendonucleasa, solo actúan en linfocitos en desarrollo y son responsables de los cortes en la cadena ADN. Otros enzimas de este conjunto se ocupan de unir los segmentos génicos seleccionados.Para que los enzimas de recombinación actúen, tienen que reconocer una secuencia de 7 bases (la secuencia de inserción), que va por delante de cada segmento excepto del segmento δ. Esa secuencia es el lugar por el que se corta el DNA.

Para que se puedan llevar a cabo las recombinaciones hace falta la participación de dos enzimas: las recombinasas codificadas en los genes RAG-1 y RAG-2. Estas recombinasas sólo se expresan en células inmaduras y además solo se activan en los linfocitos B y en los linfocitos T, en el resto de células del organismo permanecen inactivas. Para poder actuar, las recombinasas tienen que reconocer las secuencias de inserción mencionadas anteriormente, que están constituidas por 7 bases que se repiten varias veces.

Este DNA recombinado se transcribe creando un transcrito primario con información para VDJ, μ (mu) y δ (delta). En el RNAm definitivo se encontrará información únicamente para uno de los dos, bien para μ (mu) o para δ (delta). Dependiendo de la cadena que se exprese en cada RNAm maduro, se generarán respectivamente IgM o IgD.

La recombinación de VDJ esta dirigida por unos segmentos génicos muy conservados denominados señales de recombinación. Estas están formadas por un heptamero y un nonamero conservados, separados por una región espaciadora no conservada de 12 o 23pb.

Las regiones espaciadoras son importantes para que el proceso se realice de forma ordenada, ya la secuencia señal que tiene un separado de 12pb solo se puede unir a una con 23pb.

Estas secuencias se encuentran de forma alterna en los diferentes segmentos génicos.

La recombinación somatica es imprescindible para que se expresen las Ig, ya que permite la transcripción de los genes.

Reordenamiento de las cadenas ligeras

Este reordenamiento de los genes de la cadena L comienza siempre con el reordenamiento de los genes de la cadena k, se produce en todas las células Pre-B de manera independiente y cada célula Pre-B reordena los genes de la cadena k al AZAR.

Este reordenamiento consiste en recombinaciones somáticas: tomar 1 segmento génico Vk y 1segmento génico Jk al azar , unirlos y a continuación unir esta nueva región genética VJ a la región genética del dominio constante.

Al final de estos procesos si el reordenamiento de genes tiene sentido la célula sintetiza cadenas k, con lo que se sintetiza una molécula IgM completa y expresa el receptorpara el antígeno (BCR) clase IgM y la célula pasa a estadío LB inmaduro.

En la cadena ligera pasa lo mismo que en la pesada pero en este DNA no hay segmentos D, solamente V y J. Por eso en cada célula se combinará un V con un J, sin un D, y después se transcribirá en un RNA primario para posteriormente quitar los intrones y traducirlo, creando la cadena ligera.

Exclusion alelica

Cada LB presenta en su membrana un solo tipo de Ig, con dos sitios de unión, pero idénticos por lo que tiene una sola especificidad (monoespecifidad). Esto es debido a que, aunque existen dos genes para cada cadena de Ig, solo uno es reordenado de forma productiva. Esto se denomina exclusión alélica. Asi el el LB responde a un determinado antígeno y produce anticuerpos que se unen exclusivamente a él.

Como siempre, poseemos dos alelos (materno y paterno) para cada uno de los genes de las inmunoglobulinas. Las recombinaciones somáticas de la cadena μ comienza en uno cualquiera de ellos:

Este proceso de recombinación tiene un orden y unas reglas. Una de ellas es laexclusión alélica. En cada célula Pro-B tenemos dos oportunidades para conseguir un reordenamiento productivo de los genes de las cadenas pesadas.

Lo primero que se va a reordenar son los genes de la cadena pesada, empezando por uno de los alelos. Si ese alelo es productivo se crea un RNAm de μ que permite la fabricación de una cadena pesada, además de inhibir el reordenamiento del otro alelo del gen. Además, la síntesis de la cadena pesada activa el reordenamiento de la cadena ligera.

exclusion-alelica

Si el alelo de la cadena pesada escogido no fuera productivo se iniciaría el reordenamiento del otro alelo de la misma forma que lo ha hecho el primero.  Si ninguno de los dos alelos fuera productivo, la célula estaría destinada a la apoptosis por no ser útil.

La aparición en el citoplasma de las cadenas μ estimula el reordenamiento de uno de los alelos de la cadena ligera κ.

En cada célula Pre-B tenemos 4 oportunidades para conseguir un reordenamiento productivo de los genes de las cadenas pesadas.

Con la cadena ligera ocurre prácticamente lo mismo. La célula reordena uno de los alelos que codifica para κ (kappa) y si es productivo continúa con la transcripción. Por lo tanto, inhibe el otro alelo y también el segmento que codifica para λ (lambda). Si no fuese productivo continuaría con el reordenamiento del otro alelo de κ. Si ninguno de los dos alelos de kappa fuera productivo pasaría al reordenamiento de de las zonas de lambda, siguiendo el mismo proceso que con las cadenas kappa. Si finalmente ninguno de los 4 alelos fuera productivo la célula pasaría al proceso de apoptosis.

exclusion-alelica2

El CDR3 es la zona que corresponde al empalme VJ en la cadena ligera, o al de VDJ en la cadena pesada.

Mecanismos de diversidad de la union

La diversidad de repertorio natural de BCR que hasta ahora hemos conseguido se ve aumentada por dos nuevos mecanismos:

Diversidad de unión: las recombinasas no son muy precisas y cuando cortan el DNA pueden cortar uno o unos pocos nucleótidos mas o menos. Esta imprecisión incrementa la diversisdad ya que puede cambiar el marco de lectura al añadir o quitar nucleotidos. Los nucleótidos arrastrados durante la recombinación se llaman nucleótidos P (suelen ser palindromicos).

recombinasas
diversidad-union

El enzima TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) añade nucleótidos, a los que se llama nucleótidos N, en las uniones VHDH y DH JH. Solo actúa sobre el ADN de las cadenas pesadas porque, en los LB, el enzima TdT solo se expresa durante el reordenamiento de estas cadenas, en la célula Pro-B.

Combinando V, (D), J y los nucleótidos N/P se consigue que los Ig de cada linfocito sean únicos, y especialmente únicos en la región CDR3. Esta característica se emplea en el análisis de tumores, para saber si son monoclonales (una célula mutada) o policlonales (más de una célula mutada).

En resumen los mecanismos de variabilidad de las inmunoglobulinas son:

  • Múltiples genes V, D y J ( cadena H) y V y J ( cadena L)
  • Reordenamiento de genes V, D y J al azar en la cadena H
  • Reordenamiento de genes V y J al azar en la cadena L. Todos los reordenamientos de la cadena L son independientes de los de la cadena H. Así es posible que se produzca el mecanismo 4.
  • Combinaciones de todos los reordenamientos V, D y J posibles de la cadena H con todos los reordenamientos V y J posibles de la cadena L
  • Diversidad en la unión: nucleótidos P y N

El repertorio potencial de linfocitos B que podrían salir de la médula ósea es de unos 1011 clones distintos. En la práctica hay unos 107 clones, porque muchos linfocitos B fracasan en el proceso de generación de receptores y muchos fenotipos “teóricos” no llegan a ver la luz.

Coexpresión de IgM e IgD

El exón ( VDJ ) que codifica el dominio variable de la cadena H y que se ha generado por recombinación somática queda próximo a Sm (secuencia de inserción con m). Por ello la primera cadena pesada que se sintetiza es la μ. Esta secuencia de inserción es compartida por m y d y el exón VDJ puede ser transcripto con los genes Cm o Cd.

Una vez que el LB expresa en membrana el receptor IgM comienza a transcribirse la cadena d y al expresarse el receptor IgD, el LB, transcribirá alternativamente uno u otro hasta su activación por el antígeno.

IgM e IgD son las primeras clases de Ig que un linfocito B puede producir, aún sin ser activado.

Al principio, genera RNAm para cadenas μ (sólo se producen IgM): el transcrito primario de RNAm lleva la información de VDJ, μ y δ; se elimina la información de δ y se fabrican cadenas μ, que al asociarse con cadenas ligeras dan lugar a IgM.

Más adelante se hace un splicing alternativo para μ y para δ (dando lugar tanto a IgM como a IgD): en la maduración del RNAm se elimina alternativamente la información de una de las cadenas y se produce la otra, que al unirse a las cadenas ligeras da lugar a IgM o a IgD. El idiotipo, aún así, será igual en ambas Ig, a pesar de que su isotipo cambie.

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